摘要
本研究表明副干酪乳杆菌能够在果胶酸钙微珠（CPB）上形成具有高细胞密度（＞10logCFU/g）的20μm球形微菌落。微菌落内的细菌结构组织良好，并通过合成胞外聚合物（EPS）粘附在由果胶酸钙制成的三维网络中，微菌落显示出类似生物膜的表型，增强了副干酪乳杆菌的益生特性。CPB中的细菌发育过程中，相邻微菌落之间会出现聚结现象，使得微生物在微珠内空间化分布。此外，包裹在微珠中的副干酪乳杆菌细胞表现出对模拟胃肠道中遇到的恶劣条件，如酸性应激（pH1.5）、渗透应激（4.5MNaCl）、冷冻干燥过程和联合应激的抵抗力增强。体内实验结果表明，在口服CPB制备的副干酪乳杆菌的小鼠中，生物被膜微菌落细胞在结肠环境中从CPB基质中成功释放，而且CPB附着的益生菌降低了结肠炎小鼠的患病严重程度，缓解小鼠结肠粘膜损伤、炎症和体重减轻。本研究提供了一种增强益生菌生物被膜形成的载体，对促进益生特性的发挥具有积极作用。
主要内容（1）背景
世界卫生组织(WHO)将益生菌定义为“活的微生物，当摄入足够量时，它可以对宿主产生健康益处“，乳酸杆菌是哺乳动物胃肠道中的常见微生物群，一些菌株被认为是潜在的益生菌。益生菌一般为口服给药，其必须应对胃肠道中的不利条件，控制释放位置和速率，以确保最大益生特性的发挥。海藻酸盐和果胶等多糖具有天然、无*、生物相容性和低成本等优势，可以用于封装益生菌。
果胶与钙离子接触时通过外部凝胶化形成果胶钙微珠（CPB），其D网络能够捕获和固定细菌，提高细菌对外部压力的抵抗力，从而提高其生存能力。CPB对胃酸具有抗性，并且能够被结肠中的细菌酶特异性降解，从而使其可用作结肠靶向分子递送的载体。乳杆菌生物被膜的形成增强了其对宿主细胞的益生作用，乳杆菌科生物膜对胃肠道环境相关条件具有抗性，并产生大量具有免疫调节特性的细胞外因子，对于抑制人类巨噬细胞中LPS攻击诱导的炎症。（2）研究方法与结果
包裹在果胶钙微珠中的副干酪乳杆菌生物膜样微菌落的制备。将4%浓度的果胶与益生菌溶液混合，利用封装器制备成小粒径颗粒，然后加入氯化钙封装固定；不含有益生菌的CPB作为安慰剂（图1a），封装有益生菌的CPB在MRS中培养48h以形成益生菌生物被膜（图1b）。
图1：CPB微珠及其附着益生菌生物被膜的制备流程
CPB微珠中副干酪乳杆菌生物被膜的形成过程。益生菌在24h的菌体数量稳定在10LogCFU左右，激光共聚焦显微镜观察表明益生菌在CPB微球中形成微菌落（图2c），显微结构观察表明益生菌微菌落由致密的细胞组成，并在细胞间观察到胞外物质的产生（图2d）。图2：CPB微珠中副干酪乳杆菌生物被膜的形成过程。d）1-2为CLSM图像，-6为Cryo-SEM图像。
CPB制备的副干酪乳杆菌生物膜微菌落的压力响应。与浮游态细胞相比，生物被膜的形成显著提高了益生菌对酸、渗透压和冻干条件的耐受性（图a），在模拟胃肠道的条件下，生物被膜态细胞的存活率显著比游离态高，同时CPB包裹的被膜细胞比未包裹的生物被膜存活率高（图b）。图：CPB制备的副干酪乳杆菌生物膜微菌落的压力响应
副干酪乳杆菌生物膜微菌落在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的肠炎小鼠中的存活和定殖。DSS是葡聚糖的聚离子衍生物，肠炎模型中的DSS模型是通过小鼠口服DSS水溶液来模拟慢性肠炎。图4a为服用CPB制备的益生菌后的选择性培养计数结果，DSS处理后的小鼠粪便中均观察到游离态和被膜态细菌；在结肠中，被膜态细胞特别是包裹在CPB中的生物被膜态细胞在结肠壁的附着率最高（图4b-c）。图4：CPB包裹的副干酪乳杆菌生物被膜细胞在肠道中的存活和定殖
此外，CPB包裹的副干酪乳杆菌生物膜微菌落对DSS诱导的小鼠结肠炎具有保护作用，显著缓解了小鼠体重减轻和结肠组织损伤程度，通过对相关细胞因子的表达测定，表明CPB包裹的副干酪乳杆菌能够缓解小鼠炎症反应（见原文）。总结本研究将益生菌附着于果胶钙微珠制成含有生物被膜态细胞的益生菌制剂，提高了益生菌的益生特性。副干酪乳杆菌在CPB中的生物被膜形成过程为：在t=0h时，细菌随机分布在果胶钙微珠内外壁中；t=15h，随机粘附的细菌生长为分布在微珠中的微菌落（生物被膜样）；在t=24h，微菌落内的细菌继续生长，并发生微菌落重组，即微菌落相互合并和覆盖。这导致微菌落数量的减少以及它们的表面和球形度的增加。在t=48h，微菌落间继续合并形成大型微菌落，其分布变得在微珠外围集中。
图5：副干酪乳杆菌在CPB中的生物被膜形成过程
参考文献：HeumannA,AssifaouiA,DaSilvaBarreiraD,etal.Intestinalreleaseofbiofilm-likemicrocoloniesencasedincalcium-pectinatebeadsincreasesprobioticpropertiesofLacticaseibacillusparacasei.NPJBiofilmsMicrobiomes.Oct28;6(1):44.
“年轻人要多看文献”
更新于.6.15
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